Categoria: Biotecnologie

Il Paradigma Biotecnologico

Le biotecnologie impiegano organismi viventi o loro componenti molecolari per sviluppare soluzioni tecnologiche. Si dividono in:

• Biotecnologie tradizionali (approccio macro): sfruttano i processi biochimici spontanei di microrganismi nel loro stato originale (es. la fermentazione).
• Biotecnologie innovative (approccio micro): si fondano sull’ingegneria genetica e sulla tecnologia del DNA ricombinante, manipolando attivamente il genoma per indurre l’espressione di nuove funzioni molecolari (es. la sintesi di insulina umana).

Isolamento del DNA e Taglio Molecolare

Il workflow molecolare inizia con l’estrazione del DNA, ottenuto tramite lisi cellulare con tensioattivi (che solubilizzano le membrane fosfolipidiche) e successiva precipitazione in etanolo freddo. Il materiale purificato viene poi tagliato dalle endonucleasi di restrizione (“forbici molecolari”), enzimi batterici che idrolizzano i legami fosfodiesterici in corrispondenza di specifiche sequenze palindromiche. Il taglio può generare estremità piatte o estremità coesive ; queste ultime, grazie a basi sporgenti a singolo filamento, facilitano l’unione termodinamicamente stabile di frammenti di DNA di origini diverse.

Clonaggio Genico

Il frammento isolato (inserto) viene inserito in un vettore di clonaggio, solitamente un plasmide batterico (DNA circolare extracromosomico). Dopo aver tagliato inserto e plasmide con lo stesso enzima di restrizione per garantirne la complementarità, la DNA ligasi salda i filamenti creando il DNA ricombinante. Questo vettore viene introdotto in cellule ospiti (Escherichia coli) tramite shock termico (trasformazione batterica). I batteri trasformati vengono infine selezionati piastrandoli su terreni contenenti un antibiotico: solo le cellule che hanno incorporato il plasmide (vettore del gene di resistenza) sopravviveranno, replicando l’inserto.

Amplificazione Esponenziale: La PCR

Per copiare in vitro specifiche sequenze geniche si utilizza la PCR (Reazione a Catena della Polimerasi), ideata da Kary Mullis nel 1983 (Premio Nobel nel 1993). La reazione richiede: il DNA stampo, i primer (inneschi oligonucleotidici), la Taq Polimerasi (enzima termostabile isolato da Thermus aquaticus), i dNTPs (nucleotidi liberi) e un tampone con cloruro di magnesio.

All’interno di un termociclatore si compiono 25-35 cicli strutturati in tre fasi:

1. Denaturazione : l’energia termica scinde i legami a idrogeno, separando la doppia elica.
2. Appaiamento: i primer si ibridano sulle sequenze complementari del singolo filamento.
3. Estensione : la Taq Polimerasi sintetizza il nuovo filamento in direzione 5′ a 3′.

Ogni ciclo raddoppia matematicamente il DNA bersaglio , generando miliardi di copie in poche ore.

Elettroforesi su Gel di Agarosio

Per verificare l’amplificazione si applica l’elettroforesi su gel di agarosio. Sotto l’effetto di un campo elettrico continuo, i frammenti di DNA (carichi negativamente per i gruppi fosfato) migrano dal catodo (-) all’anodo (+).

La matrice di agarosio funge da setaccio molecolare: la mobilità elettroforetica è inversamente proporzionale al logaritmo delle paia di basi (bp). I frammenti più corti e leggeri migrano più rapidamente verso il fondo, mentre quelli lunghi e pesanti avanzano lentamente. La dimensione viene stimata per confronto con un Marker (scala di riferimento a pesi noti). Le bande, invisibili a occhio nudo, vengono visualizzate esponendo ai raggi UV il gel pre-trattato con coloranti intercalanti fluorescenti.

Orizzonti Applicativi

Queste metodologie trovano impiego eclettico in molteplici settori:

• Diagnostica medica: identificazione di patogeni (es. PCR per SARS-CoV-2) e screening di mutazioni oncologiche o ereditarie.
• Scienze forensi: DNA profiling da micro-tracce biologiche (saliva, sangue, capelli) per indagini criminali.
• Medicina legale: test di paternità e accertamenti di consanguineità.
• Archeologia molecolare: amplificazione e studio del DNA antico estratto da fossili e reperti mummificati.

Il sistema CRISPR-CAS9 rappresenta la tecnologia di editing genomico più precisa, versatile ed economica a disposizione della comunità scientifica. Si tratta di un adattamento del sistema immunitario dei batteri. Questi “schedano” il DNA dei virus che li attaccano e, in caso di una nuova infezione, usano la proteina Cas9, una sorta di forbice molecolare, per tagliare e distruggere il DNA virale.

Una delle caratteristiche fondamentali è la capacità della Cas9 di distinguere tra il DNA del virus e quello del batterio stesso, evitando l’autoimmunità. Questo avviene grazie alla sequenza PAM: una piccola sequenza segnale( per esempio NGG) presente nel virus ma assente nel batterio. Senza questa la Cas9 non riceve l’input per tagliare. Per rendere questo sistema utilizzabile in biotecnologia, le scienziate Charpentier e Doudna hanno semplificato i componenti naturali creando un sgRNA, ovvero una guida sintetica che i ricercatori possono programmare con una sequenza di 20 nucleotidi per dirigere la Cas9 verso qualsiasi gene bersaglio in qualsiasi organismo.

Dato che il nostro DNA è protetto all’interno del nucleo, Cas9, di origine batterica, deve essere “taggata” dal segnale NLS, una sequenza di amminoacidi, per poter superare la batteria nucleare.

Per quanto riguarda il delivery, la consegna del sistema nelle cellule, si utilizzano diverse strategie: la Microiniezione per gli embrioni (per gli animali); vettori virali o liposomi per trasportare il gene della Cas9 e della guida all’interno dei tessuti.

 Una volta che la Cas9 effettua il taglio, la cellula attiva i suoi meccanismi di riparazione. L’NHEJ, la cellula riattacca i pezzi commettendo errori e questo serve per il knockout, in cui si spegne un gene per studiarne la funzione. L’HDR, se forniamo un DNA stampo corretto, la cellula lo usa come guida per riparare il taglio in modo perfetto, permettendo la correzione di mutazioni genetiche.

Le potenzialità di questa tecnica sono enormi, infatti, ad esempio si può contrastare la malaria modificando intere popolazioni di zanzare; anche in ambito medico si stanno già trattando malattie come l’anemia falciforme.

Se l’editing sulle cellule somatiche è ormai una realtà accettata, l’intervento sugli embrioni, linea germinale, resta una grande sfida.

Modificare il DNA che verrà tramandato alle generazioni future ci fa riflettere su quanto sia giusto spingersi nel riscrivere i segreti della vita.